上海核酸酶p1

A. 哪家有國產核酸酶

Biolonase核酸酶 就是國產的。質量還不錯。品牌 上海拜朗

B. 安利佳的出版著作

五年來共發表文章120餘篇，SCI收錄42篇，主要文章包括：
1. Properties of A. ficuum AS3.324 phytase expressed in tobacco. Process Biochemistry,2005,40:213–216SCI
2. Purification,characterization and gene cloning of a novel phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon blomhoffii ussurensis. The International Journal of Biochemical & Cell Biology. 2005,37:558-565 SCI
3. Neuroprotective properties of catalpol in transient global cerebral ischemia in gerbils: dose-response,therapeutic time-window and long-term efficacy. Brain Research,2004,1029:179-185SCI
4. Plasmodium falciparum histone acetyltransferase,a yeast GCN5 homologue involved in chromatin remodeling. Eukaryotic Cell,2004,3（2）：264-276
5. Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-inced PC12 cells by preventing cytochrome c release and inactivating of caspase casecade. Toxicon,2004,43:53-59
6. PfADA2,a Plasmodium falciparum homologue of the transcriptional coactivator ADA2 and its in vivo association with the histone acetyltransferase PfGCN5. Gene,2004,336:251-261
7. Construction of Targeting Vector and Expression of Green Fluorescent Protein in the Silkworm,Antheraea pernyi. DNA and Cell Biology. 2003,22:441-446
8. The Expression of GFP Under the Control of Fibroin Promotor in Primary ovarian cells of Antheraea pernyi. Journal of Biosciences,2003,28（6）：691-695
9. 菟絲子提取物在PC12細胞株中的神經營養因子樣活性。生物化學與生物物理進展。2003,30（2）：226-230
10. Codonopsis pilosula (Franch) Nannf total alkaloids potentiate neurite outgrowth inced by nerve growth factor in PC12 cells. Acta Pharmacologica Sinica,2003,24（9）：913-917
11. Effect of Cuscuta chinensis glycoside on the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells. International Journal of Developmental Neuroscience,2003,21:277-281
12. Hydrogen peroxide-inced apoptosis in PC12 cells and the protective effect of puerarin. Cell Biology International,2003,27:1025-1031
13. Neuroprotective effect of Alpinia oxyphylla Miq. fruits against glutamate-inced apoptosis in cortical neurons. Toxicology Letters,2003,144（2）：205–212
14. Neuroprotective effect of Alpinia oxyphylla extract against glutamate excitotoxicity in cultured mouse cortical neurons. Neurosci Res Commun,2003,33（2）：105–113
15. Investigation of the neuronal death mode inced by glutamate treatment in serum-,antioxidant-free primary cultured cortical neurons. Developmental Brain Research,2003,145（2）：263-268
16. A new way for chemical degradation of plastic by natural volatile constituents of Lem palustre. Chinese Science Bulletin,2003,48（16）：1718-1721
17. Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusant of Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via rection in plasma membrane permeability. Biotechnology Letters,2003,25:1191-1194
18. Dextromethorphan protects dopaminergic neurons against inflammation-mediated degeneration through inhibition of microglial activation. The Journal Of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2003,305（1）：212-218
19. 酸性水溶液中硫氰酸鉬(V)配合物的研究。光譜學與光譜分析，2003,23（2）337-339
20. Purification and characterization of ulva pertusa kjellm alkaline phosphatase. Preparative Biochemistry & Biotechnology,2003,33（2）：113-123
21. Cloning of cDNA Encoding Choline Monooxygenase from Suaeda liaotungensis and Salt Tolerance of Transgenic Tobacco. Acta Botanica Sinica,2003,45（2）：242-247
22. Molecular cloning and characterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Suaeda liaotungensis and its use in improved tolerance to salinity in transgenic tobacco. Biotechnol Lett. 2003,25（17）：1431-1436
23. Characterization of Sporothric schenckii by random amplication of polymorphic DNA assay. Chinese Medicine Journal,2003,116（2）：239-242
24. Expression of gloshedobin,a thrombin-like enzyme from the venom of Gloydius sheensis,in Escherichia coli. Biotechnology Letters,2003,25（2）：101–104
25. High-level expression of a soluble snake venom enzyme,gloshedobin,in E. coli in the presence of metal ions. Biotechnology Letters,2003,25（8）：607–610
26. Purification and characterization of ginsenoside--arabinofuranase hydrolyzing ginsenoside Rc into Rd from the fresh root of Panax ginseng. Process Biochemistry,2002,37:793-798
27. Cloning and Expression of defibrase cDNA from the venom of Gloydius sheensis. Biotechnology Letters,2002,24:135-138
28. Cloning Expression and Purification of Gussrobin A Thrombin-like Enzyme from the Snake Venom of Gloydius ussuriensis. Prog Biochem Biophys. 2002,34（1）：6-10
29. Expression,Purification and Partial Characterization of Recombinant Defibrase,a Thrombin-Like Enzyme from the Venom of Glyodius sheensis. Prog Biochem Biophys. 2002,29（3）390-393
30. Proction of a Functional Single-chain Fv Protein in Transgenic Tobacco Root Exudates. Biotechnology letters. 2002,24（18）：1531-1534
31. An expeditious method for constructing T-vectors using Eam 1105 Ⅰ cassettes. Plant Molecular Biology Reporter,2002,20:189a-189e
32. Application of DNA sequencing in detection of telomerase activity. Biochemical Engineering Journal. 2002,11（2-3）：79-85
33. Proction of high affinity human single-chain antibody against preS1 of Hepatitis B Virus: comparison of large naïve and in vitro immune phage displayed antibody library. Progressing in Biochemistry and Biophysics. 2002,29（4）：572-575
34. Inhibition by naloxone stereoisomers of beta-amyloid peptide （1-42）-inced superoxide proction in microglia and degeneration of cortical and mesencephalic neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2002,302（3）：1212-1219
35. A Serum- and Antioxidant-free Primary Culture Model of Mouse Cortical Neurons for Pharmacological Screen and Studies of Neurotrophic and Neuroprotective Agents. Cellular and Molecular Neurobiology. 2002,22（2）：197-206
36. Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperon GRP94 in human lung cancer tissues and its clinical significance. Chinese Medical Journal,2002,115（11）：1615-1619
37. Embryonic stem cell as nuclear donor could promote in vitro development of the heterogeneous reconstructed embryo. Chinese Science Bulletin,2002,47（21）：1811-1815
38. 銅鋅超氧化物歧化酶與色氨酸鈷（Ⅱ）的相互作用。光譜學與光譜分析，2000,3:305-307
39. 紫外-可見吸收光譜法測定配合顯色反應的焓變。光譜學與光譜分析，2001,21（4）：527-528
40. Kinetics of Inactivation of Ulva pertusa Kjellm Alkaline Phosphatase by Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium. Journal of Enzyme Inhibition,2001,16:313-319
41. Purification and Characterization of ginsenoside-?-Glucosidase from Ginseng. Chem. Pharm. Bull,2001,49（7）：795-798
42. 分光光度法研究EDTA對小牛腸鹼性磷酸酶的不可逆抑制動力。光譜學與光譜分析，2001,21（5）：701-703
43. 鹼性磷酸梅與Cu （Ⅱ） 相互作用的譜學研究。光譜學與光譜分析，2001,21（4）：432-434
44. 氨基醯化酶與Cu（Ⅱ）相互作用的譜學研究。光譜學與光譜分析，2001,21（6）：804-806
45. 可見光譜學研究核酸酶P1與氯化銅（Ⅱ）的相互作用。光譜學與光譜分析，2000,20（3）：308-310
46. 大連蛇島蝮蛇類凝血酶基因克隆與表達研究。大連理工大學學報，2003,43（2）：156-159
47. 新的重組蛋白表達系統——植物根分泌和葉分泌。生物化學與生物物理進展，2003,30（1）：128
48. 抗乙肝病毒表面抗原PreS1（20-47）的單鏈抗體在轉基因煙草根分泌物中的初步表達。高技術通訊，2003,13（9）：35-38
49. Variation and characterization analysis of partial fragment of fibroin gene from silkworm,Antheraea pernyi. High Technology Letters,2003,9（3）：29-32
50. 喜樹鹼生物合成途徑及其代謝調控的研究進展。高技術通訊，2004,14（5）：106-110
51. 菟絲子提取物對PC12細胞中GAP-43表達影響。大連理工大學學報，2004,44（3）：378-382
52. Rapid Amplification of 5′cDNA End of Suaeda liaotungensis Choline Monooxygenase Using Inverse PCR RACE. High Technol Lett2002,8（1）：5-7
53. Separation and purification of betaine aldehyde dehydrogenase from wild Suaeda liaotungensis. High Technology Letters,2002,8（2）：5-17
54. Cloning a Full-length cDNA Encoding UDP-glucose Pyrophosphorylase from Amorpha Fruticosa by PCR-Based Methods. High Technology Letters,2002,8（3）：5-10
55. An Lijia. A co-expression system based on phage and phagemid to select cognate antibody-antigen pairs in vivo. High Technology Letters,2002,8（2）：5-10
56. Construction of Large Human Single-chain Antibody Phage Display Library. High Technology Letters,2002,8（3）：1-4
57. 精子幹細胞轉染法制備轉基因兔的研究。高技術通訊，2001,11（130）：17-21
58. 反向嵌套PCR高效擴增遼寧鹼蓬甜菜鹼醛脫氫酶cDNA 5』末端序列。高技術通訊，2001,1（11）：17-19
59. Research on telomerase detection of activity by combining DNA sequence analysis with TRAP. High Technology Letters,2001,7（3）：8-10
60. 新型染料配基對鹼性磷酸酶的親合純化。高校化學工程學報，2001,5（6）：563-567
61. Separation and Purification of Thrombin-like Enzyme by Affinity Adsorbents. High Technology Letters，2001,7（4）：13-15
62. 卵黃免疫球蛋白配基親和純化鹼性磷酸酶。中國農業科學，2004,37（6）：908-911

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32. 核酸酶P1的初步分離純化(字數:13293,頁數:25 )
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45. 微生物發酵法生產HA的研究(字數:13233,頁數:30 )

D. 為什麼叫核酸酶P1

核酸酶P1是核酸酶的一種。
之所以叫P1，是因為它是在桔青黴（ Penicillium citrinum）上發現的第一個核酸酶。
參考文獻：

Nucleic Acids Res. 1977 Dec;4(12):4091-108.The use of nuclease P1 in sequence analysis of end group labeled RNA.

E. 核酸酶P1和核酸酶S1的區別

酶、核酶、核酸酶到底有何區別?
酶是活細胞合成的、對其特異底物起高效催化作用的蛋白質,是機體內催化各種代謝反應最主要的催化劑.
核酶和脫氧核酶是具有高效、特異催化作用的核糖核酸和脫氧核糖核酸,是近年來發現的另一類生物催化劑,為數不多,主要作用於核酸.
核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,依據其底物的不同可以將其分為DNA酶和RNA酶兩類.

F. 如何獲取目的基因片段

提RNA反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行擴增才能排除內含子的干擾，要知道你的研究對象是真核生物。

G. AT轉變為GC的編輯問題〈分子生物學〉

摘要 .一種在細胞內進行基因定點替換的方法，其特徵在於，包括步驟：(i)提供一細胞以及第一載體和第二載體，其中所述第一載體含有第一核酸構建物，所述第二載體含有表達sgRNA的表達盒，其中，所述第一核苷酸具有5』-3』(5』至3』)的式I結構：P1-X1-L1-X2-X3 (I)；其中，P1為第一啟動子序列；X1為腺嘌呤脫氨酶的編碼序列；L1為無或連接序列；X2為突變型Cas9核酸酶的編碼序列，所述的Cas9核酸酶是無切割活性或單鏈切割活性的；X3為polyA序列；並且，各「-」獨立地為鍵或核苷酸連接序列

H. P. chrysogenum-10是什麼

產黃青黴（Penicillium chrysogenum）青黴的一種
青黴（Penicillium）
青黴屬半知菌綱。營養菌絲無色，淡色，有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，頂端形成掃帚狀的分枝，小梗頂端串生分生孢子，分生孢子球形，橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生長時呈藍綠色。
青黴菌分布廣泛，種類很多。其中產黃青黴（Penicillium chrysogenum）用於生產葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青黴素醯化酶（主要作用於青黴素V）、果膠酶、纖維素酶CX等，桔青素（Penicillium citrinum）用於生產5—磷酸 二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。

I. 限制性內切酶是什麼

限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）:識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。

[別名] Endodeoxyribonuclease

[酶反應] 限制性內切酶能分裂DNA分子在一限定數目的專一部位上。它能識別外源DNA並將其降解。

[單位定義] 在指明pH與37℃，在0.05mL反應混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位。

[性狀] 製品不含非專一的核酸水解酶(由10單位內切酶與1μg λDNA，保溫16小時所得的凝膠電泳圖譜的穩定性表示)。

限制性核酸內切酶的命名；一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)。例如，從Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性內切酶稱為Bam H，在同一品系細菌中得到的識別不同鹼基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。

在生物體內有一類酶，它們能將外來的DNA切斷，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科學家已從原核生物中分離出了許多種限制酶，並且已經商品化，在基因工程中廣泛使用。根據限制酶切割的特點，可將它們分為兩大類：一類是切割部位無特異性的；另一類是可特異性地識別核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上進行切割。這種能被特異性識別的切割部位都具有迴文序列，也就是在切割部位，一條鏈正向讀的鹼基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。在基因工程中使用的多數是後一類酶。限制酶在特定切割部位進行切割時，按照切割的方式，又可以分為錯位切和平切兩種。錯位切一般是在兩條鏈的不同部位切割，中間相隔幾個核苷酸，切下後的兩端形成一種迴文式的單鏈末端，這個末端能與具有互補鹼基的目的基因的DNA片段連結，故稱為黏性末端。這種酶在基因工程中應用最多。另一種是在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無黏性末端的平口。

在基因操作過程中，除了限制酶以外，還要用一系列的酶類，才能完成全過程。例如，鹼性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端轉移酶、多核苷酸酶、逆轉錄酶等。這些酶都有各自特殊的催化功能，現在都有商品出售，可以根據不同的需要選用。

簡短定義：

DNA限制性內切酶：
生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。

限 制 性 內 切 酶 綜 述
(Restriction Endonucleases: An Overview)

30多年前，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時，首次發現了限制性內切酶。細菌可以抵禦新病毒的入侵，而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功於細胞內部可摧毀外源DNA的限制性內切酶。首批被發現的限制性內切酶包括來源於大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源於Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點切開DNA，產生可體外連接的基因片段。研究者很快發現內切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。

當限制性內切酶的應用在上世紀七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內切酶。除了某些病毒以外，限制性內切酶只在原核生物中被發現。人們正在從數以千計的細菌及古細菌中尋找新的限制性內切酶。而對已測序的原核基因組數據分析表明，限制性內切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的細菌和古細菌似乎都能編碼限制性內切酶。

限制性內切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如Pvu II（157個氨基酸），也可以比1250個氨基酸的Cje I更大。在已純化分類的3000種限制性內切酶中，已發現了超過250種的特異識別序列。其中有30%是在NEB發現的。對具有未知特異識別序列的限制性內切酶的研究發現工作仍在繼續。人們從分析細胞提取物的生化角度研究的同時，也採用計算機分析已知的基因組數據，以期有更多的發現。盡管很多新發現的酶的識別序列與已有的重復--即同裂酶，仍然有識別新位點的酶不斷被發現。

上世紀80年代，NEB開始克隆並表達限制性內切酶。克隆技術由於將限制性內切酶的表達與原有細胞環境分離開來，避免了原細胞中其它內切酶的污染，從而提高了酶的純度。此外，克隆技術提高了限制性內切酶的產量，簡化了純化過程，使得生產成本顯著降低；克隆的基因很容易進行測序分析，表達出的蛋白也能進行X射線結晶分析，這使得我們對於克隆產物更加確定。

限制性內切酶 一、限制與修飾（Restriction and modification）

1．限制與修飾現象
早在 50 年代初，有許多學者發現了限制與修飾現象，當時稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）。 l 噬菌體表現的現象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉染頻率可說明這一問題（表 2-1）。 l 在感染某一宿主後，再去感染其它宿主時會受到限制。
E.coli 菌株 λ噬菌體感染率

lK lB lC
E.coli K 1 10-4 10-4
E.coli B 10-4 1 10-4
E.coli C 1 1 1
說明 K 和 B 菌株中存在一種限制系統，可排除外來的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修飾系統作用的結果，此時限制系統還未起作用。而在 C 菌株不能限制來自 K 和 B 菌株的 DNA 。限製作用實際就是限制酶降解外源 DNA ，維護宿主遺傳穩定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤 A 成為 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成為 5' 甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。

2．限制酶的發現
在 20 世紀 60 年代，人們就注意到 DNA 在感染宿主後會被降解的現象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次從 E.coli K 中分離到限制酶，它有特定的識別位點但沒有特定的切割位點，其中切割位點離識別位點達 1000bp 以上。
1970 年，美國約翰·霍布金斯大學的 H. Smith 於偶然中發現，流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ，其細胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，從而找到 HindⅡ 限制性內切酶。 HindⅡ 限制性內切酶位點和切割位點如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
從此以後，發現的限制酶越來越多，並且許多已經在實踐中得到應用。 EcoRⅠ 是應用最廣泛的限制性內切酶，酶切位點和切割位點如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'

限制性內切酶的命名遵循一定的原則，主要依據來源來定，涉及宿主的種名、菌株號或生物型。命名時，依次取宿主屬名第一字母，種名頭兩個字母，菌株號，然後再加上序號（羅馬字）。如 HindⅢ 限制性內切酶， Hin 指來源於流感嗜血桿菌， d 表示來自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序號。以前在限制性內切酶和修飾酶前加 R 或 M ，且菌株號和序號小寫。但現在限制性內切酶名稱中的 R 省略不寫。
1986 年下半年發現 615 種限制酶和 98 種甲基化酶； 1998 年發現 10000 種細菌或古細菌中存在 3000 種酶，且酶有 200 多種特異性。到 2005 年 1 月，共發現 4342 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 種，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 種，甲基化指導的限制酶有 3 種，商業化的限制酶有 588 種，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 種特異性。

3．限制與修飾系統的種類
根據酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統至少可分為四類。表 2-2 是各種限制與修飾系統的比較。
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制與修飾系統所佔的比例最大，達 93% 。 Ⅱ 型酶相對來說最簡單，它們識別迴文對稱序列，在迴文序列內部或附近切割 DNA ，產生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團的 DNA 產物，需 Mg2+ 的存在才能發揮活性，相應的修飾酶只需 SAM 。識別序列主要為 4-6bp ，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數酶識別更長的序列或簡並序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制與修飾系統，占 5% ，與 Ⅱ 型具有相似的輔因子要求，但識別位點是非對稱，也是非間斷的，長度為 4-7bp ，切割位點可能在識別位點一側的 20bp 范圍內。
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個彼此按相反方向結合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在 DNA 鏈的兩個互補位點上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個甲基轉移酶來完成，分別作用於其中一條鏈，但甲基化的鹼基在兩條鏈上是不同的。
在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制與修飾系統的種類很少，只佔 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個亞基存在於酶分子中，另外還有負責識別 DNA 序列的 S 亞基，分別由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因編碼，屬於同一操縱子（轉錄單位）。 EcoK 編碼基因的結構為 R2M2S 。 EcoB 編碼基因的結構為 R2M4S2 。
EcoB 酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點， N 表示任意鹼基。
TGA*（N）8TGCT
EcoK 酶的識別位點如下，其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點。
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點在識別位點 1000bp 以外，且無特異性。
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制與修飾系統的種類更少，所佔比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它們的識別位點分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點則在下游 24-26bp 處。
在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系統中的種類。
表2-2：各種限制與修飾系統的比較

Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
內切酶與甲基化酶
分子不在一起
三亞基雙功能酶
二亞基雙功能酶
識別位點
4-6bp, 大多數為迴文對稱結構
二分非對稱
5-7bp 非對稱

切割位點 在識別位點中或靠近識別位點
無特異性，至少在識別位點外 1000bp
在識別位點下游 24-26bp

限制反應與甲基化反應
分開的反應
互斥
同時競爭

限製作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes

二、限制酶識別的序列

1．限制酶識別序列的長度
限制酶識別序列的長度一般為 4-8 個鹼基，最常見的為 6 個鹼基（表2-3）。當識別序列為 4 個和 6 個鹼基時，它們可識別的序列在完全隨機的情況下，平均每 256 個和 4096 個鹼基中會出現一個識別位點（4^4=256，4^6=4096）。以下是幾個有代表性的種類，箭頭指切割位置。
4 個鹼基識別位點：Sau3AⅠ ↓GATC
5 個鹼基識別位點：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 個鹼基識別位點：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 個鹼基識別位點：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 個鹼基識別位點：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的鹼基如下。
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶識別序列的結構
限制酶識別的序列大多數為迴文對稱結構，切割位點在 DNA 兩條鏈相對稱的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識別序列和切割位置如下。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的識別序列不是對稱的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。識別序列後面括弧內的數字表示在兩條鏈上的切割位置。
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可識別多種序列，如 AccⅠ 識別的序列是 GT↓MKAC ，也就是說可識別 4 種序列，其中兩種是對稱的，另兩種是非對稱的。 HindⅡ 識別的序列是 GTY↓RAC 。

有一些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意鹼基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它們的識別序列如下。
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C

3．限制酶切割的位置
限制酶對 DNA 的切割位置大多數在內部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側和單側之別。切點在兩端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在兩側的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性與其它酶不同，它們在識別位點的兩端各切開一個斷點，而不是只產生一個斷點。切點在識別位點外側的還有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶產生的末端
1．限制酶產生匹配粘端（matched ends）
識別位點為迴文對稱結構的序列經限制酶切割後，產生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。若在對稱軸 5' 側切割底物， DNA 雙鏈交錯斷開產生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ；若在 3'-側切割，則產生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶產生平末端（Blunt end）
在迴文對稱軸上同時切割 DNA 的兩條鏈，則產生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。產生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。
3．限制酶產生非對稱突出端
許多限制酶切割 DNA 產生非對稱突出端。當識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的識別切割位點如下。
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶識別簡並序列，其識別的序列中有幾種是非對稱的。如 AccⅠ ，它的識別切割位點如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對稱。
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶識別間隔序列，間隔區域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ

J. 人工染色體的常用載體

（Yeast artificial chromosomes YACs）PYAC4 遺傳結構圖
YAC 人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復制元件構建的載體，其工作環境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鍾；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。
1．YAC人工染色體載體的復制元件和標記基因
在 YAC 載體中最常用的是 pYAC4 。由於酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體， YAC 載體以環狀的方式存在，並增加了普通大腸桿菌質粒載體的復制元件和選擇標記，以便保存和增殖。
YAC 載體的復制元件是其核心組成成分，其在酵母中復制的必需元件包括復制起點序列即自主復制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用於有絲分裂和減數分裂功能的著絲粒 （centromere , CEN）和兩個端粒（TEL）。
YAC 載體為能夠滿足自主復制、染色體在子代細胞間的分離及保持染色體穩定的需要，必須含有以下元件：
·端粒重復序列（telomeric repeat ， TEL）：定位於染色體末端一段序列，用於保護線狀的 DNA 不被胞內的核酸酶降解，以形成穩定的結構。
·著絲粒（centromere ， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點， 使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中 。在 YAC 中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。
·自主復制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向復制所必須的信號。
YAC 載體的選擇標記主要採用營養缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基本培養基上形成紅色菌落，當帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在於細胞中時，可抑制 ade 2-1基因的突變效應，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉變的現象，可用於篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （Bacterial artificial chromosomes，BACs）
1．F 質粒
大腸桿菌的 F 因子是一個約 100kb 的質粒。它編碼60多種參與復制、分配和接合過程的蛋白質（Willetts and Skurray，1987）。雖然F因子通常以雙鏈閉環DNA（1-2個拷貝/細胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個位點處進行隨機整合（Low，1987）。攜帶F因子的細胞，或以游離狀態或以整合狀態表達三根發樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產生性接觸所必需。 是基於大腸桿菌的 F 質粒構建的，高通量低拷貝的質粒載體。每個環狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來源於大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個易於 DNA 復制的由 ATP 驅動的解旋酶（ （RepE） 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。第一代 BAC 載體 （Shizuya et al. 1992） 不含那些能夠用於區分攜帶重組子的抗生素抗性細菌菌落與攜帶空載體的細菌菌落的標記物。新型的 BAC 載體可以通過α互補的原理篩選含有插入片段的重組子，並設計了用於回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位點和用於克隆 DNA 測序的 Sp6 啟動子、 T7 啟動子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not Ⅰ 識別序列，位點十分稀少。重組子通過 Not Ⅰ 消化後，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是來源於噬菌體的啟動子，用於插入片段末端測序。圖 3-28 是 pBeloBAC11 遺傳結構圖。
BAC 與 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色體 ） 相似，沒有包裝限制，因此可接受的基因組 DNA 大小也沒有固定的限制。大多數 BAC 文庫中克隆的平均大小約 120kb ，然而個別的 BAC 重組子中含有的基因組 DNA 最大可達 300kb 。
F 質粒能夠編碼形成性菌的蛋白，通過大腸桿菌的結合轉移可以進行遺傳物質的轉移。但是基因操作的時候一般不用這種自發的轉化方式。 BAC 載體空載時大小約 7.5kb ，在大腸桿菌中以質粒的形式復制，具有一個氯黴素抗性基因。外源基因組 DNA 片段可以通過酶切、連接克隆到 BAC 載體多克隆位點上，通過電穿孔的方法將連接產物導入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源 DNA 後的重組質粒通過氯黴素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互補篩選。
三、P1 噬菌體載體和 P1 人工染色體載體 （Bacteriophage P1 vectors）
是 Sternberg 基於 P1 噬菌體構建的，與黏粒載體工作原理比較相似的一種高通量載體。它含有很多 P1 噬菌體來源的順式作用元件，能容納 70～100kb 大小的基因組DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在這種系統中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中，後者總容量可達 115kb （包括載體和插入片段）。將重組 DNA 注射到表達 Cre 重組酶的大腸桿菌中，線狀 DNA 分子通過重組於載體的兩個 loxP 位點之間而發生環化。另外，載體還攜帶一個通用的選擇標記 kan r ，一個區分攜帶外源 DNA 克隆的陽性標記 sacB 以及一個能夠使每個細胞都含有約一個拷貝環狀重組質粒的 P1 質粒復制子。另一個 P1 復制子（ P1 裂解性復制子）在可誘導的 lac 啟動子（IPTG 誘導）控制下，用於 DNA 分離前質粒的擴增。圖 3-29 是 P1 噬菌體載體 pAd10sacBII 的遺傳結構圖。2．P1 人工染色體（P1 artificial chromosomes）
結合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性，包括陽性選擇標記 sacB 及噬菌體 P1 的質粒復制子和裂解性復制子。然而除了將連接產物包裝進入噬菌體顆粒以及在 cre-loxP 位點使用位點特異性重組產生質粒分子以外，在載體連接過程中產生的環狀重組 PAC 也可能用電穿孔的方法導入大腸桿菌中，並且以單拷貝質粒狀態維持 （Ioannou et al. 1994） 。基於 PAC 的人類基因組文庫插入片段的大小在 60kb～150kb 之間。