上海核酸酶p1

A. 哪家有国产核酸酶

Biolonase核酸酶 就是国产的。质量还不错。品牌 上海拜朗

B. 安利佳的出版著作

五年来共发表文章120余篇，SCI收录42篇，主要文章包括：
1. Properties of A. ficuum AS3.324 phytase expressed in tobacco. Process Biochemistry,2005,40:213–216SCI
2. Purification,characterization and gene cloning of a novel phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon blomhoffii ussurensis. The International Journal of Biochemical & Cell Biology. 2005,37:558-565 SCI
3. Neuroprotective properties of catalpol in transient global cerebral ischemia in gerbils: dose-response,therapeutic time-window and long-term efficacy. Brain Research,2004,1029:179-185SCI
4. Plasmodium falciparum histone acetyltransferase,a yeast GCN5 homologue involved in chromatin remodeling. Eukaryotic Cell,2004,3（2）：264-276
5. Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-inced PC12 cells by preventing cytochrome c release and inactivating of caspase casecade. Toxicon,2004,43:53-59
6. PfADA2,a Plasmodium falciparum homologue of the transcriptional coactivator ADA2 and its in vivo association with the histone acetyltransferase PfGCN5. Gene,2004,336:251-261
7. Construction of Targeting Vector and Expression of Green Fluorescent Protein in the Silkworm,Antheraea pernyi. DNA and Cell Biology. 2003,22:441-446
8. The Expression of GFP Under the Control of Fibroin Promotor in Primary ovarian cells of Antheraea pernyi. Journal of Biosciences,2003,28（6）：691-695
9. 菟丝子提取物在PC12细胞株中的神经营养因子样活性。生物化学与生物物理进展。2003,30（2）：226-230
10. Codonopsis pilosula (Franch) Nannf total alkaloids potentiate neurite outgrowth inced by nerve growth factor in PC12 cells. Acta Pharmacologica Sinica,2003,24（9）：913-917
11. Effect of Cuscuta chinensis glycoside on the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells. International Journal of Developmental Neuroscience,2003,21:277-281
12. Hydrogen peroxide-inced apoptosis in PC12 cells and the protective effect of puerarin. Cell Biology International,2003,27:1025-1031
13. Neuroprotective effect of Alpinia oxyphylla Miq. fruits against glutamate-inced apoptosis in cortical neurons. Toxicology Letters,2003,144（2）：205–212
14. Neuroprotective effect of Alpinia oxyphylla extract against glutamate excitotoxicity in cultured mouse cortical neurons. Neurosci Res Commun,2003,33（2）：105–113
15. Investigation of the neuronal death mode inced by glutamate treatment in serum-,antioxidant-free primary cultured cortical neurons. Developmental Brain Research,2003,145（2）：263-268
16. A new way for chemical degradation of plastic by natural volatile constituents of Lem palustre. Chinese Science Bulletin,2003,48（16）：1718-1721
17. Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusant of Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via rection in plasma membrane permeability. Biotechnology Letters,2003,25:1191-1194
18. Dextromethorphan protects dopaminergic neurons against inflammation-mediated degeneration through inhibition of microglial activation. The Journal Of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2003,305（1）：212-218
19. 酸性水溶液中硫氰酸钼(V)配合物的研究。光谱学与光谱分析，2003,23（2）337-339
20. Purification and characterization of ulva pertusa kjellm alkaline phosphatase. Preparative Biochemistry & Biotechnology,2003,33（2）：113-123
21. Cloning of cDNA Encoding Choline Monooxygenase from Suaeda liaotungensis and Salt Tolerance of Transgenic Tobacco. Acta Botanica Sinica,2003,45（2）：242-247
22. Molecular cloning and characterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Suaeda liaotungensis and its use in improved tolerance to salinity in transgenic tobacco. Biotechnol Lett. 2003,25（17）：1431-1436
23. Characterization of Sporothric schenckii by random amplication of polymorphic DNA assay. Chinese Medicine Journal,2003,116（2）：239-242
24. Expression of gloshedobin,a thrombin-like enzyme from the venom of Gloydius sheensis,in Escherichia coli. Biotechnology Letters,2003,25（2）：101–104
25. High-level expression of a soluble snake venom enzyme,gloshedobin,in E. coli in the presence of metal ions. Biotechnology Letters,2003,25（8）：607–610
26. Purification and characterization of ginsenoside--arabinofuranase hydrolyzing ginsenoside Rc into Rd from the fresh root of Panax ginseng. Process Biochemistry,2002,37:793-798
27. Cloning and Expression of defibrase cDNA from the venom of Gloydius sheensis. Biotechnology Letters,2002,24:135-138
28. Cloning Expression and Purification of Gussrobin A Thrombin-like Enzyme from the Snake Venom of Gloydius ussuriensis. Prog Biochem Biophys. 2002,34（1）：6-10
29. Expression,Purification and Partial Characterization of Recombinant Defibrase,a Thrombin-Like Enzyme from the Venom of Glyodius sheensis. Prog Biochem Biophys. 2002,29（3）390-393
30. Proction of a Functional Single-chain Fv Protein in Transgenic Tobacco Root Exudates. Biotechnology letters. 2002,24（18）：1531-1534
31. An expeditious method for constructing T-vectors using Eam 1105 Ⅰ cassettes. Plant Molecular Biology Reporter,2002,20:189a-189e
32. Application of DNA sequencing in detection of telomerase activity. Biochemical Engineering Journal. 2002,11（2-3）：79-85
33. Proction of high affinity human single-chain antibody against preS1 of Hepatitis B Virus: comparison of large naïve and in vitro immune phage displayed antibody library. Progressing in Biochemistry and Biophysics. 2002,29（4）：572-575
34. Inhibition by naloxone stereoisomers of beta-amyloid peptide （1-42）-inced superoxide proction in microglia and degeneration of cortical and mesencephalic neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2002,302（3）：1212-1219
35. A Serum- and Antioxidant-free Primary Culture Model of Mouse Cortical Neurons for Pharmacological Screen and Studies of Neurotrophic and Neuroprotective Agents. Cellular and Molecular Neurobiology. 2002,22（2）：197-206
36. Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperon GRP94 in human lung cancer tissues and its clinical significance. Chinese Medical Journal,2002,115（11）：1615-1619
37. Embryonic stem cell as nuclear donor could promote in vitro development of the heterogeneous reconstructed embryo. Chinese Science Bulletin,2002,47（21）：1811-1815
38. 铜锌超氧化物歧化酶与色氨酸钴（Ⅱ）的相互作用。光谱学与光谱分析，2000,3:305-307
39. 紫外-可见吸收光谱法测定配合显色反应的焓变。光谱学与光谱分析，2001,21（4）：527-528
40. Kinetics of Inactivation of Ulva pertusa Kjellm Alkaline Phosphatase by Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium. Journal of Enzyme Inhibition,2001,16:313-319
41. Purification and Characterization of ginsenoside-?-Glucosidase from Ginseng. Chem. Pharm. Bull,2001,49（7）：795-798
42. 分光光度法研究EDTA对小牛肠碱性磷酸酶的不可逆抑制动力。光谱学与光谱分析，2001,21（5）：701-703
43. 碱性磷酸梅与Cu （Ⅱ） 相互作用的谱学研究。光谱学与光谱分析，2001,21（4）：432-434
44. 氨基酰化酶与Cu（Ⅱ）相互作用的谱学研究。光谱学与光谱分析，2001,21（6）：804-806
45. 可见光谱学研究核酸酶P1与氯化铜（Ⅱ）的相互作用。光谱学与光谱分析，2000,20（3）：308-310
46. 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究。大连理工大学学报，2003,43（2）：156-159
47. 新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌。生物化学与生物物理进展，2003,30（1）：128
48. 抗乙肝病毒表面抗原PreS1（20-47）的单链抗体在转基因烟草根分泌物中的初步表达。高技术通讯，2003,13（9）：35-38
49. Variation and characterization analysis of partial fragment of fibroin gene from silkworm,Antheraea pernyi. High Technology Letters,2003,9（3）：29-32
50. 喜树碱生物合成途径及其代谢调控的研究进展。高技术通讯，2004,14（5）：106-110
51. 菟丝子提取物对PC12细胞中GAP-43表达影响。大连理工大学学报，2004,44（3）：378-382
52. Rapid Amplification of 5′cDNA End of Suaeda liaotungensis Choline Monooxygenase Using Inverse PCR RACE. High Technol Lett2002,8（1）：5-7
53. Separation and purification of betaine aldehyde dehydrogenase from wild Suaeda liaotungensis. High Technology Letters,2002,8（2）：5-17
54. Cloning a Full-length cDNA Encoding UDP-glucose Pyrophosphorylase from Amorpha Fruticosa by PCR-Based Methods. High Technology Letters,2002,8（3）：5-10
55. An Lijia. A co-expression system based on phage and phagemid to select cognate antibody-antigen pairs in vivo. High Technology Letters,2002,8（2）：5-10
56. Construction of Large Human Single-chain Antibody Phage Display Library. High Technology Letters,2002,8（3）：1-4
57. 精子干细胞转染法制备转基因兔的研究。高技术通讯，2001,11（130）：17-21
58. 反向嵌套PCR高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5’末端序列。高技术通讯，2001,1（11）：17-19
59. Research on telomerase detection of activity by combining DNA sequence analysis with TRAP. High Technology Letters,2001,7（3）：8-10
60. 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲合纯化。高校化学工程学报，2001,5（6）：563-567
61. Separation and Purification of Thrombin-like Enzyme by Affinity Adsorbents. High Technology Letters，2001,7（4）：13-15
62. 卵黄免疫球蛋白配基亲和纯化碱性磷酸酶。中国农业科学，2004,37（6）：908-911

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32. 核酸酶P1的初步分离纯化(字数:13293,页数:25 )
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41. 注射用奥扎格镭钠细菌内毒素检查方法学研究(字数:13009,页数:27 )
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43. 牛初乳中乳铁蛋白提取工艺的研究(字数:12126,页数:23 )
44. 对三氟甲基苯腈的合成(字数:7844,页数:19 )
45. 微生物发酵法生产HA的研究(字数:13233,页数:30 )

D. 为什么叫核酸酶P1

核酸酶P1是核酸酶的一种。
之所以叫P1，是因为它是在桔青霉（ Penicillium citrinum）上发现的第一个核酸酶。
参考文献：

Nucleic Acids Res. 1977 Dec;4(12):4091-108.The use of nuclease P1 in sequence analysis of end group labeled RNA.

E. 核酸酶P1和核酸酶S1的区别

酶、核酶、核酸酶到底有何区别?
酶是活细胞合成的、对其特异底物起高效催化作用的蛋白质,是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂.
核酶和脱氧核酶是具有高效、特异催化作用的核糖核酸和脱氧核糖核酸,是近年来发现的另一类生物催化剂,为数不多,主要作用于核酸.
核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,依据其底物的不同可以将其分为DNA酶和RNA酶两类.

F. 如何获取目的基因片段

提RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行扩增才能排除内含子的干扰，要知道你的研究对象是真核生物。

G. AT转变为GC的编辑问题〈分子生物学〉

摘要 .一种在细胞内进行基因定点替换的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒，其中，所述第一核苷酸具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：P1-X1-L1-X2-X3 (I)；其中，P1为第一启动子序列；X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；L1为无或连接序列；X2为突变型Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；X3为polyA序列；并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列

H. P. chrysogenum-10是什么

产黄青霉（Penicillium chrysogenum）青霉的一种
青霉（Penicillium）
青霉属半知菌纲。营养菌丝无色，淡色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，顶端形成扫帚状的分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形，椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。
青霉菌分布广泛，种类很多。其中产黄青霉（Penicillium chrysogenum）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素V）、果胶酶、纤维素酶CX等，桔青素（Penicillium citrinum）用于生产5—磷酸 二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。

I. 限制性内切酶是什么

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

[别名] Endodeoxyribonuclease

[酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。

[单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。

[性状] 制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示)。

限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。

在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在基因工程中使用的多数是后一类酶。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

在基因操作过程中，除了限制酶以外，还要用一系列的酶类，才能完成全过程。例如，碱性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等。这些酶都有各自特殊的催化功能，现在都有商品出售，可以根据不同的需要选用。

简短定义：

DNA限制性内切酶：
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。

限 制 性 内 切 酶 综 述
(Restriction Endonucleases: An Overview)

30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。

当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。

限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。其中有30%是在NEB发现的。对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。

上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。

限制性内切酶 一、限制与修饰（Restriction and modification）

1．限制与修饰现象
早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。
E.coli 菌株 λ噬菌体感染率

lK lB lC
E.coli K 1 10-4 10-4
E.coli B 10-4 1 10-4
E.coli C 1 1 1
说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

2．限制酶的发现
在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。
1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'

限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ 限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。

3．限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S 。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。
TGA*（N）8TGCT
EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。
在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系统中的种类。
表2-2：各种限制与修饰系统的比较

Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶
分子不在一起
三亚基双功能酶
二亚基双功能酶
识别位点
4-6bp, 大多数为回文对称结构
二分非对称
5-7bp 非对称

切割位点 在识别位点中或靠近识别位点
无特异性，至少在识别位点外 1000bp
在识别位点下游 24-26bp

限制反应与甲基化反应
分开的反应
互斥
同时竞争

限制作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes

二、限制酶识别的序列

1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-3）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。
4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。

有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下。
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C

3．限制酶切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5' 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ；若在 3'-侧切割，则产生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶产生平末端（Blunt end）
在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。
3．限制酶产生非对称突出端
许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的识别切割位点如下。
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ

J. 人工染色体的常用载体

（Yeast artificial chromosomes YACs）PYAC4 遗传结构图
YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。
1．YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因
在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。
YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。
YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：
·端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。
·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
·自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。 （Bacterial artificial chromosomes，BACs）
1．F 质粒
大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第一代 BAC 载体 （Shizuya et al. 1992） 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not Ⅰ 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。
BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ） 相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。
F 质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互补筛选。
三、P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体 （Bacteriophage P1 vectors）
是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。2．P1 人工染色体（P1 artificial chromosomes）
结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al. 1994） 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb～150kb 之间。